今天为大家介绍一篇理性筛选分子胶降解剂的工作。
这篇于2021年发表在Science Advances的文章题为 “Targeting oncoproteins with a positive selection assay for protein degraders”，由Dana-Farber Cancer Institute的研究团队完成。
——背景——
分子胶降解剂依赖偶然发现。——主要结果——
1. 开发针对蛋白质降解剂的阳性选择检测方法
策略：将“目标蛋白降解”与“细胞存活”耦合。
原理：DCK是一种酶，可以将底物BVdU催化成对细胞有毒的物质。将DCK与目标蛋白融合。目标蛋白存在的情况下，加入BVdU，细胞死亡；目标蛋白降解时，DCK作为融合蛋白的一部分，也被同步降解，此时再加入BVdU，细胞将不会死亡。
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图1. 方法构建
方法验证1（单化合物验证）：构建DCK*-IKZF1融合蛋白，融合表达时还会共表达一个GFP蛋白，GFP信号直接反应细胞的存活情况。已知泊马渡胺（POM）是IKZF1的降解剂。加入POM，确实可以降低BVdU的毒性（图1 F，H）。
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图2. 高通量阳性筛选
方法验证2（验证方法的高通量能力）：将表达DCK*-IKZF1或未融合DCK*的293FT细胞铺板。使用一个约2000种化合物库进行高通量筛选（包含来那度胺LEN和泊马度胺POM）（图2，A至C）。最后测量每个孔的GFP荧光，并根据其所在板上其他孔的GFP荧光值将其转换为Z-Score。在DCK*-IKZF1筛选中，LEN和POM Z-Score大于2（图2 E、F中的圆点、三角），而在DCK*筛选中则接近与0（图2，B至E）。一些假阳性化合物能促进DCK*细胞和DCK*-IKZF1细胞的存活，包括干扰BVdU摄取的化合物（如双嘧达莫）或干扰BVdU掺入DNA的化合物（如胸苷）。将待测化合物在DCK*-IKZF1上的 Z-Score中减去其DCK* Z-Score（图2 F），可有效消除此类检测中的假阳性结果。
2. 阳性筛选效果好于阴性筛选。
作者还建立了阴性双荧光素酶筛选系统，通过加药后Fluc/Rluc比值的Z-Score判断目标蛋白IKZF1水平。该阴性筛选系统并没有鉴定出活性化合物LEN及POM。阴性筛选的失败，强调了将“目标蛋白降解”与“细胞存活”耦合这一策略有效性！
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图3. 阴性筛选
3. 进一步识别假阳性化合物
为了尽可能减少假阳性，作者在孔板中接种了1:1混合的293FT细胞，这些细胞分别表达（i）DCK*-IKZF1和GFP，或（ii）DCK*和TdTomato（图4A）。POM和双嘧达莫（DiP）均增加了GFP阳性细胞的数量，但通过观察TdTomato荧光通道，很容易将双嘧达莫识别为假阳性（图4B）。随后，作者筛选了100多种CELMoDs药物，成功发现了一些IKZF1降解剂，其中MI-2-61活性优于POM（图4 C至F）。
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图4. CELMoDs药物筛选4.非IMiD类IKZF1降解剂的发现
目的：寻找不依赖CRBN的IKZF1降解剂
结果：作者利用开发的系统，筛选了约546种代谢抑制剂和抗癌药物，结果显示Spautin-1以剂量依赖的方式促进DCK*-IKZF1细胞的存活，但对DCK*细胞无此作用（图5，A至D）。Spautin-1可下调DCK*-IKZF1和带有V5标签的外源性IKZF1，但不会下调DCK*（图5 E）。通过定量质谱蛋白质组学分析确定，经Spautin-1处理24小时后，IKZF1-V5是下调最显著的100种蛋白质之一。值得注意的是，与泊马度胺不同，Spautin-1在缺乏cereblon的细胞中也能下调IKZF1（图5 F）。作者试图从多角度探究Spautin-1降低IKZF1水平的分子机制，但暂时并未成功。
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图5. 发现IKZF1降解剂Spautin-1
5.将该阳性筛选体系推广至化合物池（pool）
阳性选择测定法的一个优势是能够进行 pooled 筛选。然而，作者选取的阳性选择测定法使用了自杀基因。一些自杀基因会导致旁观者杀伤效应，这可能会干扰它们在 pooled 筛选中的使用。作者通过实验证实，在经 IMiDs 和 BVdU 处理的共培养物中，DCK*-IKZF1 细胞的生长速度迅速超过 DCK* 细胞；并且在表达 DCK*-IKZF1 或 DCK*-FOXP3 并经 BVdU 处理的 Cas9 阳性 293FT 细胞中，DCK* 单向导 RNA（sgRNA）相对于对照 sgRNA 迅速且特异性地富集。因此，在该系统中，旁观者杀伤的影响可以忽略不计。
阳性选择测定法的一个优势是能够进行 pooled 筛选。ASCL1是一种不可成药的谱系特异性转录因子，是许多小细胞肺癌（SCLC）和神经母细胞瘤中的必需蛋白。作者构建了表达Cas9以及以下任意一种物质的Jurkat T细胞：（i）DCK*、（ii）神经/神经内分泌谱系特异性转录因子ASCL1、（iii）DCK*-ASCL1，或（iv）ASCL1-DCK*（图6A）。接下来，用靶向788个编码可成药蛋白的基因的慢病毒sgRNA文库（每个基因7个sgRNA）感染了ASCL1-DCK*和DCK*细胞。10天后将细胞分瓶，并在含有200或500 μM BVdU的环境中再培养2周。通过基因组DNA的下一代测序确定sgRNA的丰度，并与BVdU处理前的时间点相比，分析sgRNA的相对富集情况。结果显示，在ASCL1-DCK*细胞中，针对CDK2的多个sgRNA在两种BVdU浓度下均显著富集，而在DCK*细胞中则没有（图6C）。后续实验证明CDK2失活会破坏小细胞肺癌细胞系中ASCL1蛋白的稳定性。证明了该体系在pooled 筛选中的能力。
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图6. CDK2为ASCL1蛋白稳定剂
——小结——
作者巧妙的将将“目标蛋白降解”与“细胞存活”耦合，开发了针对POI降解剂的高通量阳性筛选体系，该阳性筛选体系效果明显优于阴性筛选体系，且可以用于pooled筛选，是药物发现的有力工具。
药物化学，活性为王。即使有了这样的体系，如果没有足够多量、多样、高质量的化合物库支撑，同样也难以筛得理想的化合物。
参考文献：
Koduri, V. et al. Targeting oncoproteins with a positive selection assay for protein degraders. Sci. Adv. 7, eabd6263 (2021). https://doi.org/doi:10.1126/sciadv.abd6263作者：任宇浩审稿：王丽莹编辑：王丽莹GoDesignID：Molecular_Design_Lab图片
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